Krew jest płynną tkanką krążącą w naczyniach krwionośnych człowieka i zwierząt kręgowych. Składa się z osocza (część płynna) oraz zawieszonych w nim komórek krwi (krwinki
czerwone, krwinki białe, płytki krwi). Objętość krwi u człowieka przeciętnie wynosi ok. 5–6
litrów. Lepkość krwi jest 4–5 razy większa niż lepkość wody. Krew wynaczyniona ulega procesowi krzepnięcia, w wyniku którego z postaci płynnej przechodzi w postać galaretowatą,
a następnie wysycha. U człowieka prawidłowy czas krzepnięcia przeciętnie wynosi 7–9 minut,
u zwierząt — w zależności od gatunku — od 0,5 minuty (ptaki) do 11–12 minut (koń). Czas ten
może się zmieniać w wyniku działania czynników środowiska, np. niska temperatura znacznie
opóźnia krzepnięcie krwi, wysoka natomiast przyspiesza ten proces (w temperaturze 10°C
krew krzepnie ok. 20 minut, w temperaturze 30°C — ok. 3 minut). Wyschnięta krew jest
wielokrotnie bardziej odporna na procesy gnicia niż krew w postaci płynnej lub galaretowatej.
Przy ocenie plam krwi należy pamiętać, że najszybciej wysycha krew z brzegów plamy.
We krwi zidentyfikowano ponad 100 układów grupowych występujących zarówno na
krwinkach, jak i w osoczu. Największe znaczenie mają układy związane z krwinkami czerwonymi: AB0 i Rh. Cechy układu AB0 warunkują istnienie czterech podstawowych grup
krwi: 0, A, B, AB. W układzie Rh największe znaczenie ma obecność lub brak antygenu D.
Jego występowanie warunkuje cechę Rh(+), brak — cechę Rh(-).
Przydatność śladów krwi do badań biologicznych może się wahać od kilku dni do kilkudziesięciu (kilkuset?) lat. Do czynników negatywnie wpływających na cechy krwi, a tym
samym ograniczających możliwości identyfikacji śladów (w tym także na podstawie DNA
zawartego w komórkach krwi) należą:
— wilgoć i wysoka temperatura,
— promieniowanie ultrafioletowe (w tym także zawarte w promieniowaniu słonecznym),
— niektóre związki chemiczne,
— obecność drobnoustrojów i pleśni w środowisku śladu.
Ślady krwi mogą występować w postaci cieczy lub różnego rodzaju plam. Ujawnianie
świeżych śladów krwi zwykle nie wymaga użycia specjalnych metod. Jeżeli ślady krwi są
widoczne, wówczas ich niektóre cechy, w tym barwa i konsystencja, umożliwiają wstępną
identyfikację. Po dłuższym czasie ślady krwi ulegają zmianom chemicznym, którym towarzyszy zmiana barwy: od czerwonej poprzez brunatną do żółtozielonej; procesom będącym
wynikiem działania czynników fizycznych (wilgoć, temperatura) oraz procesom gnilnym
związanym z obecnością drobnoustrojów. W tych wypadkach należy stosować niżej wymienione metody lub ich kombinację.
Jako metody niespecyficzne wykorzystuje się różnego rodzaju testy barwne oparte na
reakcji chemicznej z jakąś określoną substancją śladu. W wypadku śladów krwi największe
zastosowanie znalazły testy oparte na wykrywaniu enzymów zwanych peroksydazami. Ze
względu na to, że peroksydazy występują zarówno w materiale ludzkim, zwierzęcym, jak
i roślinnym, pozytywny wynik testu nie jest równoznaczny z wykryciem krwi.
Najczęściej używaną próbą barwną jest test benzydynowy. W obecności hemoglobiny
i H2
O2 dochodzi do zmiany bezbarwnej benzydyny w jej niebieską postać:
H2
O2 bezbarwna benzydyna + Hb niebieska benzydyna.
Jest to test bardzo czuły; wynik pozytywny można uzyskać przy krwi rozcieńczonej
1:100 000–1:500 000. Wyniki fałszywie dodatnie stwierdzono w obecności śliny, płynu
mózgowo-rdzeniowego oraz niektórych związków chemicznych (jodyna, tlenki ołowiu, sole
miedzi, wybielacze). Pozytywne reakcje wywołują też peroksydazy roślinne występujące
w sokach roślinnych (jabłka, morele, ziemniaki, szczaw, pomidory).
Innym testem barwnym opartym na właściwościach peroksydaz jest test fenoloftaleinowy (test Kastle-Meyera). W obecności hemoglobiny i H2
O2 bezbarwna fenoloftaleina
zmienia się w czerwoną pochodną. Jest to metoda bardzo czuła, pozwalająca na wykrycie
krwi w rozcieńczeniu od 1:2 do 1:200 000. Ograniczenia tego testu są podobne jak w wypadku innych testów opartych na właściwościach peroksydaz Test z zielenią malachitową należy także do prób wykorzystujących ich właściwości.
W obecności krwi uzyskuje się niebieskozielone zabarwienie. Czułość i ograniczenia tej
metody są podobne, jak w opisanych wyżej testach, wyniki fałszywie dodatnie występują
w obecności niektórych związków chemicznych (np. chromianów), natomiast soki roślinne,
w przeciwieństwie do innych testów, dają w większości wyniki ujemne.
Opisane próby są coraz częściej zastępowane szybkimi testami kontaktowymi, tzw.
papierkami testowymi. Zasada działania tych testów opiera się w większości także na
wykorzystaniu właściwości peroksydazowych krwi. Ograniczenia ich stosowania są zatem
podobne, jak innych tego typu testów, natomiast ogromną ich zaletą jest czułość, prostota
i szybkość wykonania. Zwykle przeprowadzenie próby polega na zwilżeniu papierka wodą
i przyłożeniu go do badanej plamy lub na nakropieniu na test kropli wyciągu z badanej
plamy. Wystąpienie reakcji barwnej świadczy o pozytywnym wyniku badania (ryc. 6.1.).
Test przeprowadza się na niewielkiej ilości próbki (plamy), której pozostałą część można
wykorzystać do dalszych badań. Tego rodzaju testy można wykorzystywać w toku oględzin
miejsca zdarzenia do typowania plam. Innym wartościowym testem do wstępnej oceny śladów krwi jest test z luminolem.
Zasada w tym wypadku jest oparta na wykazywaniu luminescencji przez hemoglobinę
i niektóre jej pochodne. Jest to, widoczne w ciemności, niebieskie świecenie badanego
obszaru (ryc. 6.2.). Reakcja zachodzi według schematu:
hemoglobina
Luminol + H2
O2 dehydroluminol + H2
O.
Ten bardzo czuły test daje pozytywne wyniki już przy rozcieńczeniu krwi w proporcji
1:1000 000. Luminolem można ujawnić ślady stare (kilkuletnie) oraz ślady zacierane
lub zmywane. Ze wszystkich stosowanych testów niespecyficznych wykazuje on najmniej
reakcji nieswoistych. Wyniki fałszywie dodatnie występują w obecności związków niektó-
rych metali (miedzi, żelaza). Wyniki fałszywie ujemne sporadycznie mogą wystąpić przy badaniu świeżej krwi. Test ten może być stosowany do badań dużych powierzchni (ściany,
podłogi, dywany), zwłaszcza w celu typowania potencjalnych miejsc występowania śladów
zacieranych (ryc. 6.2.). Sporadycznie i tylko w warunkach laboratoryjnych wykorzystuje
się go także do badań np. odzieży. Na uwagę zasługuje fakt, że luminol nie niszczy DNA
zawartego w komórkach, dlatego ślady ujawnione za jego pomocą można typować do
badań identyfikacyjnych.
W ostatnich latach pojawiły się także nowe typy testów umożliwiających dodatkowo
wstępną ocenę pochodzenia gatunkowego, np. kasetkowe testy immunochromatograficzne. Zasada działania tych testów polega na selektywnym wykrywaniu hemoglobiny krwi
ludzkiej3
w barwnej reakcji. Testy te są bardzo czułe, np. test HEM-CHECK 1 pozwala na
wykrywanie hemoglobiny w rozcieńczeniu 1:400 000. Wyniki fałszywie dodatnie są spotykane sporadycznie, natomiast wyniki fałszywie ujemne mogą wystąpić przy zbyt dużym
stężeniu krwi oraz w temperaturze poniżej 4°C. Ze względu na dużą prostotę wykonania
testy te są stosowane nie tylko w warunkach laboratoryjnych, lecz także w czasie oględzin
miejsca zdarzenia — do wstępnej oceny śladów.
Oprócz wyżej wymienionych testów sporadycznie stosuje się też inne, np. znany od
XIX w. test z wodą utlenioną, ale są one wypierane przez testy czulsze i bardziej specyficzne.
Za jedną z najlepszych specyficznych metod identyfikacji krwi jest uważana próba
mikrospektroskopowa. Polega na wykrywaniu pochodnych barwnika krwi — hemoglobiny, na podstawie obecności w obrazie widma światła widzialnego pasm pochłonnych. Liczba i grubość prążków jest charakterystyczna dla określonej pochodnej
hemoglobiny. Czułość tego testu pozwala na wykrycie krwi w rozcieńczeniu 1:200.
Wyniki fałszywie ujemne obserwowano po działaniu na plamy krwi wysokiej temperatury. Nie odnotowano wyników fałszywie dodatnich. Badanie tego typu praktycznie wykonuje się jedynie w warunkach laboratoryjnych. Sporadycznie stosowane są też
inne próby, np. spektrofotometryczne.
czerwone, krwinki białe, płytki krwi). Objętość krwi u człowieka przeciętnie wynosi ok. 5–6
litrów. Lepkość krwi jest 4–5 razy większa niż lepkość wody. Krew wynaczyniona ulega procesowi krzepnięcia, w wyniku którego z postaci płynnej przechodzi w postać galaretowatą,
a następnie wysycha. U człowieka prawidłowy czas krzepnięcia przeciętnie wynosi 7–9 minut,
u zwierząt — w zależności od gatunku — od 0,5 minuty (ptaki) do 11–12 minut (koń). Czas ten
może się zmieniać w wyniku działania czynników środowiska, np. niska temperatura znacznie
opóźnia krzepnięcie krwi, wysoka natomiast przyspiesza ten proces (w temperaturze 10°C
krew krzepnie ok. 20 minut, w temperaturze 30°C — ok. 3 minut). Wyschnięta krew jest
wielokrotnie bardziej odporna na procesy gnicia niż krew w postaci płynnej lub galaretowatej.
Przy ocenie plam krwi należy pamiętać, że najszybciej wysycha krew z brzegów plamy.
We krwi zidentyfikowano ponad 100 układów grupowych występujących zarówno na
krwinkach, jak i w osoczu. Największe znaczenie mają układy związane z krwinkami czerwonymi: AB0 i Rh. Cechy układu AB0 warunkują istnienie czterech podstawowych grup
krwi: 0, A, B, AB. W układzie Rh największe znaczenie ma obecność lub brak antygenu D.
Jego występowanie warunkuje cechę Rh(+), brak — cechę Rh(-).
Przydatność śladów krwi do badań biologicznych może się wahać od kilku dni do kilkudziesięciu (kilkuset?) lat. Do czynników negatywnie wpływających na cechy krwi, a tym
samym ograniczających możliwości identyfikacji śladów (w tym także na podstawie DNA
zawartego w komórkach krwi) należą:
— wilgoć i wysoka temperatura,
— promieniowanie ultrafioletowe (w tym także zawarte w promieniowaniu słonecznym),
— niektóre związki chemiczne,
— obecność drobnoustrojów i pleśni w środowisku śladu.
Ślady krwi mogą występować w postaci cieczy lub różnego rodzaju plam. Ujawnianie
świeżych śladów krwi zwykle nie wymaga użycia specjalnych metod. Jeżeli ślady krwi są
widoczne, wówczas ich niektóre cechy, w tym barwa i konsystencja, umożliwiają wstępną
identyfikację. Po dłuższym czasie ślady krwi ulegają zmianom chemicznym, którym towarzyszy zmiana barwy: od czerwonej poprzez brunatną do żółtozielonej; procesom będącym
wynikiem działania czynników fizycznych (wilgoć, temperatura) oraz procesom gnilnym
związanym z obecnością drobnoustrojów. W tych wypadkach należy stosować niżej wymienione metody lub ich kombinację.
Jako metody niespecyficzne wykorzystuje się różnego rodzaju testy barwne oparte na
reakcji chemicznej z jakąś określoną substancją śladu. W wypadku śladów krwi największe
zastosowanie znalazły testy oparte na wykrywaniu enzymów zwanych peroksydazami. Ze
względu na to, że peroksydazy występują zarówno w materiale ludzkim, zwierzęcym, jak
i roślinnym, pozytywny wynik testu nie jest równoznaczny z wykryciem krwi.
Najczęściej używaną próbą barwną jest test benzydynowy. W obecności hemoglobiny
i H2
O2 dochodzi do zmiany bezbarwnej benzydyny w jej niebieską postać:
H2
O2 bezbarwna benzydyna + Hb niebieska benzydyna.
Jest to test bardzo czuły; wynik pozytywny można uzyskać przy krwi rozcieńczonej
1:100 000–1:500 000. Wyniki fałszywie dodatnie stwierdzono w obecności śliny, płynu
mózgowo-rdzeniowego oraz niektórych związków chemicznych (jodyna, tlenki ołowiu, sole
miedzi, wybielacze). Pozytywne reakcje wywołują też peroksydazy roślinne występujące
w sokach roślinnych (jabłka, morele, ziemniaki, szczaw, pomidory).
Innym testem barwnym opartym na właściwościach peroksydaz jest test fenoloftaleinowy (test Kastle-Meyera). W obecności hemoglobiny i H2
O2 bezbarwna fenoloftaleina
zmienia się w czerwoną pochodną. Jest to metoda bardzo czuła, pozwalająca na wykrycie
krwi w rozcieńczeniu od 1:2 do 1:200 000. Ograniczenia tego testu są podobne jak w wypadku innych testów opartych na właściwościach peroksydaz Test z zielenią malachitową należy także do prób wykorzystujących ich właściwości.
W obecności krwi uzyskuje się niebieskozielone zabarwienie. Czułość i ograniczenia tej
metody są podobne, jak w opisanych wyżej testach, wyniki fałszywie dodatnie występują
w obecności niektórych związków chemicznych (np. chromianów), natomiast soki roślinne,
w przeciwieństwie do innych testów, dają w większości wyniki ujemne.
Opisane próby są coraz częściej zastępowane szybkimi testami kontaktowymi, tzw.
papierkami testowymi. Zasada działania tych testów opiera się w większości także na
wykorzystaniu właściwości peroksydazowych krwi. Ograniczenia ich stosowania są zatem
podobne, jak innych tego typu testów, natomiast ogromną ich zaletą jest czułość, prostota
i szybkość wykonania. Zwykle przeprowadzenie próby polega na zwilżeniu papierka wodą
i przyłożeniu go do badanej plamy lub na nakropieniu na test kropli wyciągu z badanej
plamy. Wystąpienie reakcji barwnej świadczy o pozytywnym wyniku badania (ryc. 6.1.).
Test przeprowadza się na niewielkiej ilości próbki (plamy), której pozostałą część można
wykorzystać do dalszych badań. Tego rodzaju testy można wykorzystywać w toku oględzin
miejsca zdarzenia do typowania plam. Innym wartościowym testem do wstępnej oceny śladów krwi jest test z luminolem.
Zasada w tym wypadku jest oparta na wykazywaniu luminescencji przez hemoglobinę
i niektóre jej pochodne. Jest to, widoczne w ciemności, niebieskie świecenie badanego
obszaru (ryc. 6.2.). Reakcja zachodzi według schematu:
hemoglobina
Luminol + H2
O2 dehydroluminol + H2
O.
Ten bardzo czuły test daje pozytywne wyniki już przy rozcieńczeniu krwi w proporcji
1:1000 000. Luminolem można ujawnić ślady stare (kilkuletnie) oraz ślady zacierane
lub zmywane. Ze wszystkich stosowanych testów niespecyficznych wykazuje on najmniej
reakcji nieswoistych. Wyniki fałszywie dodatnie występują w obecności związków niektó-
rych metali (miedzi, żelaza). Wyniki fałszywie ujemne sporadycznie mogą wystąpić przy badaniu świeżej krwi. Test ten może być stosowany do badań dużych powierzchni (ściany,
podłogi, dywany), zwłaszcza w celu typowania potencjalnych miejsc występowania śladów
zacieranych (ryc. 6.2.). Sporadycznie i tylko w warunkach laboratoryjnych wykorzystuje
się go także do badań np. odzieży. Na uwagę zasługuje fakt, że luminol nie niszczy DNA
zawartego w komórkach, dlatego ślady ujawnione za jego pomocą można typować do
badań identyfikacyjnych.
W ostatnich latach pojawiły się także nowe typy testów umożliwiających dodatkowo
wstępną ocenę pochodzenia gatunkowego, np. kasetkowe testy immunochromatograficzne. Zasada działania tych testów polega na selektywnym wykrywaniu hemoglobiny krwi
ludzkiej3
w barwnej reakcji. Testy te są bardzo czułe, np. test HEM-CHECK 1 pozwala na
wykrywanie hemoglobiny w rozcieńczeniu 1:400 000. Wyniki fałszywie dodatnie są spotykane sporadycznie, natomiast wyniki fałszywie ujemne mogą wystąpić przy zbyt dużym
stężeniu krwi oraz w temperaturze poniżej 4°C. Ze względu na dużą prostotę wykonania
testy te są stosowane nie tylko w warunkach laboratoryjnych, lecz także w czasie oględzin
miejsca zdarzenia — do wstępnej oceny śladów.
Oprócz wyżej wymienionych testów sporadycznie stosuje się też inne, np. znany od
XIX w. test z wodą utlenioną, ale są one wypierane przez testy czulsze i bardziej specyficzne.
Za jedną z najlepszych specyficznych metod identyfikacji krwi jest uważana próba
mikrospektroskopowa. Polega na wykrywaniu pochodnych barwnika krwi — hemoglobiny, na podstawie obecności w obrazie widma światła widzialnego pasm pochłonnych. Liczba i grubość prążków jest charakterystyczna dla określonej pochodnej
hemoglobiny. Czułość tego testu pozwala na wykrycie krwi w rozcieńczeniu 1:200.
Wyniki fałszywie ujemne obserwowano po działaniu na plamy krwi wysokiej temperatury. Nie odnotowano wyników fałszywie dodatnich. Badanie tego typu praktycznie wykonuje się jedynie w warunkach laboratoryjnych. Sporadycznie stosowane są też
inne próby, np. spektrofotometryczne.